» »

"Umetna" produkcija proteinov z biotehnologijo

"Umetna" produkcija proteinov z biotehnologijo

_marko ::

Torej, kje smo danes in kam gremo z produkcijo proteinov v "celičnih tovarnah".
To temo odpiram, ker sem v eni drugi obljubil, da bom to stvar razjasnil.

Skratka, produkcijo poljubnih proteinov v modificiranih organizmih opravljamo v bakterijah, kvasovkah in tudi filamentoznih gljivah.

Začelo se je leto 1982, ko so v E.Coli proizvedli človeški protein - inzulin.
V bakterijah se lahko proizvajajo tudi razni proteini kot npr. bovine growth hormon... itd.
Problem pri bakterijah so post-translacijske modifikacije, tvorba inkluzivnih teles, težka sekrecija, cisteinski mostovi.. itd.

Kvasovke oz filamentozne glive so boljsa izbira, ker imajo post-translacijke modifikacije podobne sesalcem.

primer: Interleukin 6
V glivi A.nidulans je bil človeški gen za IL-6 uspešno prepisan in preveden, vendar so bili donosi precej majhni.
Nato so z raznimi tehnikami donos povečali tudi za 200x. Fuzija gena z lokalnim genom je ena od teh tehnik.
Še vedno niso bili zadovoljeni z donosom, zato so zamenli gostitelja z drugo glivo in nastavljali bio-procesne pogoje (npr.pH).
Izražanje človeških genov v fuziji z lokalnimi pod nadzorom močnega promotorja je dala izjemne rezultate.

Npr. produkcija IL-6 je tudi več kot 300 mg/l.

Tako se proizvajajo tudi ENCIMI(invertaze, amilaze...), ANTIGENI (Hepatitis B surface AG, HIV-1 gp120...), REGULATORNI PROTEINI (TNF, IFN), MEMBRANSKI PROTEINI, PROTEAZE.... itd

Če koga zanimajo postopki naj vpraša. Tole zdaj je upam, da dovolj poljudno za razumevanje...

Ta tema je nastala zato, da razjasnimo ali je mogoče narediti tuje proteini v gostiteljih - celičnih tovarnah.
Torej lahko človeški gen izrazimo v kvasovkah, lahko kačjega v bakteriji.. itd...


AtaStrumf, a se strinjas?
The saddest aspect of life right now is that science
gathers knowledge faster than society gathers wisdom.

_marko ::

P.S. To še zdaleč ni vse.
Uporabljajo se razni poteinsko-eksprecijski sitemi v različnih bakterijah, glivah, (baculo)virusih, insektnih celičnih kulturah, sesalskih celičnih kulturah... itd...

Da gremo še celo dlje, uporabljajo se tehnike s katerimi se v epruveti izboljša že obstojen protein.
Torej ne-le produkcija že znanih proteiinov v drugih organizmih, ampak produkcija evoluranih proteinov poteka.
Če gremo še dlje, potekajo tudi izboljšave metabolnih poti v organizmih...

Itd...
The saddest aspect of life right now is that science
gathers knowledge faster than society gathers wisdom.

Thomas ::

A so kakšne omejitve, da recimo kaj toliko in bolj kompliciranega se pa ne da?

Ali pa recimo, da nekaterih vrst (magari preprostih) molekul pa tako ne pridobiš nikoli?

Aj je to v principu univerzalna "molekulfabrka"?
Man muss immer generalisieren - Carl Jacobi

zee ::

skoraj univerzalna.

težave nastanejo pri velikih/kompleksnih proteinih, ki jih je potrebno modificirati oz. pravilno sestaviti. Pravilna modifikacija proteina je ključnega pomena za funkcijo.
zee
Linux: Be Root, Windows: Re Boot
thorin: Dual Xeon E5-2630v3, 32 GB RAM, Nvidia Geforce GTX 1080

gzibret ::

Z napredkom biotehnologije oz. umetne izdelave proteinov, kar je v bistvu že manipulacija z materijo na atomski skali, bomo lahko dobili množico novih katalizatorjev, od takih za razgradnjo plastike, do takih za pridobivanje vodika iz smeti, nove proteine za pralne praške, ki se bodo samorazkrojili 5 ur po stiku z vodo, do svetilnih proteinov, ki bodo podnevi absorbirali UV, ponoči pa oddajali vidno svetlobo, do umetnih skrčljivih zadev, ki se bodo krčile z voltažo (adijo hidraulika), semikonduktivne membrane (zamislite si filtracijo umazane vode zgolj s pritiskom, skozi priteče le pitna voda z majhnimi ioni)....

Uporab je neskončno mnogo....
Vse je za neki dobr!

Zgodovina sprememb…

  • spremenilo: gzibret ()

_marko ::

->Ali pa recimo, da nekaterih vrst (magari preprostih) molekul pa tako ne pridobiš nikoli?
->Pravilna modifikacija proteina je ključnega pomena za funkcijo.

Načeloma se da vse. Če ne z enim organizmom pa z drugim.

Problemi so npr v bakteriji E.coli, ki enostavno ne mara kodona za arginin. Potem ko ga zamenjaš je ok.

Kar se tiče prave modifikacije jih je pomembnih kar precej. Npr.cisteinski mostovi, O-glikosilacija, N-glikosilacija, poly adenilacija, lipidna adicija ...

Ena najpomembnejših je N-glikosilacija. Bakterije je ne zmorejo, kvasovke brez dodatnih modifikacija hiperglikosilirajo protein, filamentozne glive delajo ok in mislim, da insektne celične kulture tudi.
Kvasovke se da spremenit do te mere, da delajo tudi to ok, in da je stvar aktivna v človeškem telesu. Če je glikosilacija napačna se proteini izločijo v krvni obrtok in razgradijo.


-> težave nastanejo pri velikih/kompleksnih proteinih, ki jih je potrebno modificirati oz. pravilno sestaviti.

Lahko nastanejo inklusivna telesa - torej agregacija proteinov. Ampak tudi to se, da urediti do neke mere.
Uporablajo se lahko sevi brez oz z zelo omejenimi proteaznimi aktivnosti. Obstajajo tehnike, ki že denaturiran protein spravijo v nativen.
The saddest aspect of life right now is that science
gathers knowledge faster than society gathers wisdom.

_marko ::

gzibret:
Ti omenjaš predvsem okoljsko biotehnologijo.

Načeloma se bi naj biotehnologja delila na :

RDEČO (medicina, farmacija)
ZELENO in MODRO (okoljska in agronomska)
BELO (industrijska)

P.S. veliko obljubljajo tudi sesalne celične kulture, vendar je za njih potrebno veliko dela/časa in še vse prehitro pride do infekcije z retrovirusi... Te pa imajo seveda identične modifikacije proteinov kot jih imamo mi.
Aja, pa mogoče še ma kak etik kaj za pripomnit...
The saddest aspect of life right now is that science
gathers knowledge faster than society gathers wisdom.

zee ::

samo nekaj terminov: N- in O- glikoZilacija, sesalske celice itd itd

Problem sesalskih celic je omejeno število celičnih delitev v kulturi.
zee
Linux: Be Root, Windows: Re Boot
thorin: Dual Xeon E5-2630v3, 32 GB RAM, Nvidia Geforce GTX 1080

_marko ::

zee:
Ja ok, to so malenkosti.
Te stvari sem se učil in delno počel vse v angleščini - zato pride do napak. Bom pazil odzdaj naprej...
The saddest aspect of life right now is that science
gathers knowledge faster than society gathers wisdom.

_marko ::

gzibret:
Zelo zanimive primer si naštel, a imaš kak link ali je to bolj iz glave?
The saddest aspect of life right now is that science
gathers knowledge faster than society gathers wisdom.

gzibret ::

Bolj iz glave ;)
Vse je za neki dobr!

BigWhale ::

Mene recimo precej zanima 'tissue growth', po domace snicl iz petrijevke.

gzibret ::

> Mene recimo precej zanima 'tissue growth', po domace snicl iz petrijevke.

Ali pa nova pljuča, jetra, srce....
Vse je za neki dobr!

_marko ::

Google for : "organ transplant pig human"
The saddest aspect of life right now is that science
gathers knowledge faster than society gathers wisdom.

root987 ::

_Res_ se ne spoznam na te stvari tako da me ne raztrgat če ga bom kje grdo sfaliv... :)

Pa se stvari iz gzibretovega odgovora dejansko dajo razvit/se razvijajo/so že razvite ali so bolj v domeni znanstvene fantastike?

Če zadnje - kdaj bi lahko pričakovali praktične aplikacije?
"Myths which are believed in tend to become true."
--- George Orwell

_marko ::

Definitivno ni to znanstvena fantastika.

primer: Whiter rot fungi (Phanerochaeta chrysosporium) ime zelo impresivne oskidativne lastnosti. Danes je zmožna degradirati eksplozivo TNT (tri nitro toluen), razne toxine, pesticide, cianide, azide...
The saddest aspect of life right now is that science
gathers knowledge faster than society gathers wisdom.

gzibret ::

root987 - zakaj pa se nebi dale razvit. Vse te stvari, ki sem jih naštel, dejansko v naravi že obstajajo oz. se že dogajajo (morda edinole za razgradnjo plastike ne). Pa še cela čuda drugih zadev. Umetna tkiva + mehanski deli.... V tank tankaš glukozno raztopino.....

Pa bakterije imajo čuda nekih encimov. Posebej tiste primitivne, ki znajo oksidirat vse po vrsti, samo, da dobijo tiste molekule ATP. Ne hecam se, obstajajo tudi bakterije, ki oksidirajo minerale v kamninah, nekateri kamni so dejansko "bolani", ker so jih napadle bakterije. To se dogaja sicer bolj redko, ampak se.

Tudi recimo betoni, kamnite fasade, spomeniki... propadajo pod vplivom bakterij.
Vse je za neki dobr!

antonija ::

@root987: Da se vse, sam je najprej treba vedet kaj sploh hoces. Ce bos hotel narest katalizator ki bo kataliziral reakcijo metan+kisik=metanol bos zmagal. Ampak kolikor je meni znano se nihce ne ve kako naj bi tak katalizator izgledal.

Pomojem bo slo to naprej podobno kot zdravila: izdelava knjiznjic spojin in skeniranje za aktivnost. Bo pa to ziher prislo v prakticno uporabo, razen ce ne bo kaksen etik imel prevec pripomb (po drugi strani jih pa imamo zato da dajejo pripombe...).
Statistically 3 out of 4 involved usually enjoy gang-bang experience.

_marko ::

->Pomojem bo slo to naprej podobno kot zdravila: izdelava knjiznjic spojin in skeniranje za aktivnost.

To je bilo včeraj. Danes so nove fore. Bom razložil kasneje.
The saddest aspect of life right now is that science
gathers knowledge faster than society gathers wisdom.

_marko ::

na kratko:

Imaš racionalni princip izboljševanja proteinov(encimov).
Pod to spada SOE - splicing by overlap extension.To je tehnika kjer sami določimo primerje in z točno določenimi primerji izzovemo mutacijo.
Potem imamo random izboljšave z direktno oz laboratorijsko evolucijo kjer uporabljamo tehnike z error prone PCR, DNA shuffling, ITCHY...

Nato imamo tudi "computational design of proteins". Gre praktično za re-design z računalnikom.
Potrebno je pa vedet, da je zato potrebno ogromno komputinga. (hja, zakaj ga pa ni? :))

Če želimo npr izboljšati neko aktivno domeno na proteinu in če si zato vzamemo 12-18 amino kislin, ki bodo mutirale imamo takoj vsaj 10^23 možnih sekvenc. Tukaj je potem problem screeninga in vivo ali on vitro - enostavno število možnosti je preveliko, da bi dobil najboljše - zato se uporablja komputacijski redesign.
Ko se gremo tole moramo všteti še druge spremenljivke: orientacija receptorja, liganda, razne konformacije stranskih verig, etc...
Skratka pridemo nekje med 10^53 in 10^76 permutacij.
Zato tudi obstajajo algoritmi - "energy minimization".

Nato so tudi že združili komputacijski deseign in direktno evolucijo.

Antonija pa je tudi omenil skeniranje za lastnosti.
No, na tem se tudi dela veliko. Predvsem na izboljšavah. Gre za High-throughput screening z različnimi display tehnikami.
Npr. peptide on plasmid, polysome display, viral or phage display, cell based systems. Tukaj je pa meja skeniranja pač manjša kot pri komputacijskem designu. Ampak danes se še vedno veliko uporablja - moje osebno mnenje pa je da bo komputacijski desingn odnesel boljše.
Že nam je uspelo na novo zdizajnirat protein z željeno funkcijo.(seveda je bil en protein z čisto drugačno funkcijo vzet kot "template")

Vem, da nisem razložil postopkov(pozna ura), ampak če koga zanima naj vpraša.
The saddest aspect of life right now is that science
gathers knowledge faster than society gathers wisdom.

Thomas ::

> Potem imamo random izboljšave z direktno oz laboratorijsko evolucijo

To sem hotu slišat, tudi ...
Man muss immer generalisieren - Carl Jacobi

_marko ::

Direktna oz Laboratorijska evolucija:

Direktna evolucija nudi način za optimizacijo encimov v ODSOTNOSTI strukturnih in mehanskih informacij o samem proteinu.
Uporablja preprosti, iterativni Darwinov optimizacijski algoritev.
Molekulska diverziteta je ustvarjena z random mutagenezo in/ali rekombinacijo tarčnega gena oz družine sorodnih genov.
Izboljšane različice so identificirane z screeningom na podlagi značilnosti, ki jo merimo. Ko dobimoprve izboljšave, vzamemo te encime kot primer staršev za nasledni krog evolucije.

Izboljšujemo npr stabilnost, aktivnost, enantioselektivnost...
Razvita je bila novo biokatalizna aktivnost na skupnem "scaffold" proteinu, nove tehnike za "high throughput screening"...


Tehnike v Laboratorijski evoluciji: (mutacije, rekombinacije, screening)

Random point mutagenesis: Uporabi se error prone PCR. Dodajajo se dvovalentni ioni(Mn2+) kot zamenjava za optimalne MG2+ v PCRju ali pa uporabimo high error prone polimeraze, ki nimajo popravljalnih mehanizmov, zato prihajo do napak pri prepisu.
Z tem dobimo adaptivne mutacije, če bi bila stopnja mutacije višja bi dobili neutralne oz delecije.

Ko z error prone PCR namnožimo starševski gene, dobimo knjižnico z random mutanti, ki so nato prevedeni in skenirani za željeno aktivnost.
Iz te ogromne množice pa potem dobimo enega ali več pozitivnih mutantov z željeno izboljšano lastnostjo.

Poznamo tudi DNA shuffling oz "molecular breeding", kjer je omogočena in vitro rekombinacija DNA sekvenc, ki so bolj ali manj sorodne.
DNA shuffling potrebuje stopnjo sorodnosti 55% in več. Npr Incremental truncation za kreacijo hibridnih encimov(ITCHY) pa dovoljuje manjšeo sorodnost.

DNA shuffling: vzamemo npr dva gena z neko nukleotidno sorodnostjo(večina v amino delu), ki rezultirata v sete hibridnih knjižnic. Generirani so multipli crossing overji, ki bodo v večini ravno v tem amino terminalnem delu. Dolžina rekombinantov je približno enaka starševnskim.

ITCHY: gre za 1 sam crossing over z posledično ligacijo. Rezultat je 1 crossing over na sekvenco brez regijske preference. Dolžina rekombinantov pa zelo varira (do (A+B)).

Z temi tehnikami so nor izboljšali proteinsko topnost in expresijo, enantioselektivnost, stabilnost in aktivnost v "čudnih" okoljih, naredili nove alosterične interakcije, boljše encime skozi celotno T območje... itd.
The saddest aspect of life right now is that science
gathers knowledge faster than society gathers wisdom.

pietro ::

Ali mogoče kdo ve, kje je znanost, kar se tiče napovedovanja 3D struktur proteinov?

_marko ::

Da, sekundarne strukture ti tud jaz napovem z 70% verjetnostjo. Gre pač zato, da so določene AK rade na točno določenih mestih v npr. alfa heliksu in da neketere ne morejo bit tam. Še vedno pa ne moremo napovedovat struktur z več kot max 80% verjetnostjo.

Za 3D strukture moraš pa uporabiti template protein z že znano 3D strukturo v online knjižnici Protein Data Bank, potem pa z komparativnim modelingom na ModBase database primerjaš template z željenim proteinom.

Če te pa zanimajo podrobnosti pa odpri temo.
The saddest aspect of life right now is that science
gathers knowledge faster than society gathers wisdom.

pietro ::

Z napovedovanjem na osnovi statistčnih podatkov dlje tudi ne bomo prišli. Načine, ki si mi jih omenil (_marko), so mi znani. Bolj me zanima, če že uporabljajo kakšno novo metodo, npr. semi- empirične metode (matematični modeli podkrepljeni z poenostavitvami ali laboratorijskimi podatki).

zee ::

tole napovedovanje se grem jaz dnevno v službi oz. to je moj kruh.
zee
Linux: Be Root, Windows: Re Boot
thorin: Dual Xeon E5-2630v3, 32 GB RAM, Nvidia Geforce GTX 1080

pietro ::

Zee, torej bi lahko o tem povedal kaj več!

_marko ::

zee:

Popravi me če se motim, ampak ti ne napoveduješ 3D struktur proteinov iz gole sekvence, ampak računaš dinamike, vezave npr ionov na proteine... itd
Vsaj tako si rekel nekaj časa nazaj.

Računalniške moči pa ni dovolj, da bi se šel napovedovanje zvijanja proteinov.
The saddest aspect of life right now is that science
gathers knowledge faster than society gathers wisdom.

_marko ::

Naj se naredi nova tema za te proteine, ker nekako ne spadajo sem.
pietro, zee, moderator?
The saddest aspect of life right now is that science
gathers knowledge faster than society gathers wisdom.

Thomas ::

Kakor razumem, je tole univerzalni molekularni assembler. Mau bizaren sicer, ampak nič hudega.

Glavno, da se da narest čudne molekule, potem bomo že ... magari bomo v celicah vzgojili take molekule, da celic ne bomo potrebovali več.

Nekje tam smo, kot pri programskih jezikih. Hmmm ....
Man muss immer generalisieren - Carl Jacobi

_marko ::

Tole me je pa najbolj razveselilo:

Z laboratorijsko evoluijo (asexual process) so v 20ih ciklih in miljon skeningi dosegli enako oz še manj kot z celotnim genomskim shufflingom (hypersexual process) v 2eh ciklh in 24.000 skeningih.

Zdaj pa pride najboljsi del: "Whole genome suffling" se smatra kot tehnologija, ki NE naredi genetsko modificiranih organizmov! :)

Razlika med koncim produktim po 20 ciklih navadne laboratorijske evolucije je sev, ki ima mutacijo praktično na istem mestu kot pa tisti z celotnim genomskih shufflingom. In prvi je smatran kot genetsko modificiran organizem.

Etiki ste bumbarji, če me slišite! :)
The saddest aspect of life right now is that science
gathers knowledge faster than society gathers wisdom.

_marko ::

->Kakor razumem, je tole univerzalni molekularni assembler.

Ni ravno zelo učinkovit, ampak je pa dovolj, da bo par kemijsko - farmacevtskih domen odplaknil...
The saddest aspect of life right now is that science
gathers knowledge faster than society gathers wisdom.

Thomas ::

"AND" pa "NOT" mate. Sicer nerodna včasih nekoliko, ampak iz tega se da narest (najbrž) vse.
Man muss immer generalisieren - Carl Jacobi


Vredno ogleda ...

TemaSporočilaOglediZadnje sporočilo
TemaSporočilaOglediZadnje sporočilo
»

Evolucija deluje tudi na prione (strani: 1 2 )

Oddelek: Novice / Znanost in tehnologija
646162 (2746) mihl
»

Kaj pomeni ustvariti umetno celico?

Oddelek: Novice / Znanost in tehnologija
3110053 (8566) Seto
»

Naši raziskovalci uspešni na področju sintezne biologije

Oddelek: Novice / Znanost in tehnologija
443039 (3039) MarkoDolinar
»

Iskanje novih zdravil s simulacijami in evolucijo

Oddelek: Znanost in tehnologija
362371 (1673) dukenukem
»

Raztopina, ki bo reševala življenja (strani: 1 2 )

Oddelek: Znanost in tehnologija
615803 (4086) antonija

Več podobnih tem