"Umetna" produkcija proteinov z biotehnologijo

P.S. To še zdaleč ni vse.
Uporabljajo se razni poteinsko-eksprecijski sitemi v različnih bakterijah, glivah, (baculo)virusih, insektnih celičnih kulturah, sesalskih celičnih kulturah... itd...

Da gremo še celo dlje, uporabljajo se tehnike s katerimi se v epruveti izboljša že obstojen protein.
Torej ne-le produkcija že znanih proteiinov v drugih organizmih, ampak produkcija evoluranih proteinov poteka.
Če gremo še dlje, potekajo tudi izboljšave metabolnih poti v organizmih...

Itd...

skoraj univerzalna.

težave nastanejo pri velikih/kompleksnih proteinih, ki jih je potrebno modificirati oz. pravilno sestaviti. Pravilna modifikacija proteina je ključnega pomena za funkcijo.

->Ali pa recimo, da nekaterih vrst (magari preprostih) molekul pa tako ne pridobiš nikoli?
->Pravilna modifikacija proteina je ključnega pomena za funkcijo.

Načeloma se da vse. Če ne z enim organizmom pa z drugim.

Problemi so npr v bakteriji E.coli, ki enostavno ne mara kodona za arginin. Potem ko ga zamenjaš je ok.

Kar se tiče prave modifikacije jih je pomembnih kar precej. Npr.cisteinski mostovi, O-glikosilacija, N-glikosilacija, poly adenilacija, lipidna adicija ...

Ena najpomembnejših je N-glikosilacija. Bakterije je ne zmorejo, kvasovke brez dodatnih modifikacija hiperglikosilirajo protein, filamentozne glive delajo ok in mislim, da insektne celične kulture tudi.
Kvasovke se da spremenit do te mere, da delajo tudi to ok, in da je stvar aktivna v človeškem telesu. Če je glikosilacija napačna se proteini izločijo v krvni obrtok in razgradijo.


-> težave nastanejo pri velikih/kompleksnih proteinih, ki jih je potrebno modificirati oz. pravilno sestaviti.

Lahko nastanejo inklusivna telesa - torej agregacija proteinov. Ampak tudi to se, da urediti do neke mere.
Uporablajo se lahko sevi brez oz z zelo omejenimi proteaznimi aktivnosti. Obstajajo tehnike, ki že denaturiran protein spravijo v nativen.

samo nekaj terminov: N- in O- glikoZilacija, sesalske celice itd itd

Problem sesalskih celic je omejeno število celičnih delitev v kulturi.

gzibret:
Zelo zanimive primer si naštel, a imaš kak link ali je to bolj iz glave?

Mene recimo precej zanima 'tissue growth', po domace snicl iz petrijevke.

Google for : "organ transplant pig human"

Definitivno ni to znanstvena fantastika.

primer: Whiter rot fungi (Phanerochaeta chrysosporium) ime zelo impresivne oskidativne lastnosti. Danes je zmožna degradirati eksplozivo TNT (tri nitro toluen), razne toxine, pesticide, cianide, azide...

@root987: Da se vse, sam je najprej treba vedet kaj sploh hoces. Ce bos hotel narest katalizator ki bo kataliziral reakcijo metan+kisik=metanol bos zmagal. Ampak kolikor je meni znano se nihce ne ve kako naj bi tak katalizator izgledal.

Pomojem bo slo to naprej podobno kot zdravila: izdelava knjiznjic spojin in skeniranje za aktivnost. Bo pa to ziher prislo v prakticno uporabo, razen ce ne bo kaksen etik imel prevec pripomb (po drugi strani jih pa imamo zato da dajejo pripombe...).

na kratko:

Imaš racionalni princip izboljševanja proteinov(encimov).
Pod to spada SOE - splicing by overlap extension.To je tehnika kjer sami določimo primerje in z točno določenimi primerji izzovemo mutacijo.
Potem imamo random izboljšave z direktno oz laboratorijsko evolucijo kjer uporabljamo tehnike z error prone PCR, DNA shuffling, ITCHY...

Nato imamo tudi "computational design of proteins". Gre praktično za re-design z računalnikom.
Potrebno je pa vedet, da je zato potrebno ogromno komputinga. (hja, zakaj ga pa ni? :))

Če želimo npr izboljšati neko aktivno domeno na proteinu in če si zato vzamemo 12-18 amino kislin, ki bodo mutirale imamo takoj vsaj 10^23 možnih sekvenc. Tukaj je potem problem screeninga in vivo ali on vitro - enostavno število možnosti je preveliko, da bi dobil najboljše - zato se uporablja komputacijski redesign.
Ko se gremo tole moramo všteti še druge spremenljivke: orientacija receptorja, liganda, razne konformacije stranskih verig, etc...
Skratka pridemo nekje med 10^53 in 10^76 permutacij.
Zato tudi obstajajo algoritmi - "energy minimization".

Nato so tudi že združili komputacijski deseign in direktno evolucijo.

Antonija pa je tudi omenil skeniranje za lastnosti.
No, na tem se tudi dela veliko. Predvsem na izboljšavah. Gre za High-throughput screening z različnimi display tehnikami.
Npr. peptide on plasmid, polysome display, viral or phage display, cell based systems. Tukaj je pa meja skeniranja pač manjša kot pri komputacijskem designu. Ampak danes se še vedno veliko uporablja - moje osebno mnenje pa je da bo komputacijski desingn odnesel boljše.
Že nam je uspelo na novo zdizajnirat protein z željeno funkcijo.(seveda je bil en protein z čisto drugačno funkcijo vzet kot "template")

Vem, da nisem razložil postopkov(pozna ura), ampak če koga zanima naj vpraša.

Direktna oz Laboratorijska evolucija:

Direktna evolucija nudi način za optimizacijo encimov v ODSOTNOSTI strukturnih in mehanskih informacij o samem proteinu.
Uporablja preprosti, iterativni Darwinov optimizacijski algoritev.
Molekulska diverziteta je ustvarjena z random mutagenezo in/ali rekombinacijo tarčnega gena oz družine sorodnih genov.
Izboljšane različice so identificirane z screeningom na podlagi značilnosti, ki jo merimo. Ko dobimoprve izboljšave, vzamemo te encime kot primer staršev za nasledni krog evolucije.

Izboljšujemo npr stabilnost, aktivnost, enantioselektivnost...
Razvita je bila novo biokatalizna aktivnost na skupnem "scaffold" proteinu, nove tehnike za "high throughput screening"...


Tehnike v Laboratorijski evoluciji: (mutacije, rekombinacije, screening)

Random point mutagenesis: Uporabi se error prone PCR. Dodajajo se dvovalentni ioni(Mn2+) kot zamenjava za optimalne MG2+ v PCRju ali pa uporabimo high error prone polimeraze, ki nimajo popravljalnih mehanizmov, zato prihajo do napak pri prepisu.
Z tem dobimo adaptivne mutacije, če bi bila stopnja mutacije višja bi dobili neutralne oz delecije.

Ko z error prone PCR namnožimo starševski gene, dobimo knjižnico z random mutanti, ki so nato prevedeni in skenirani za željeno aktivnost.
Iz te ogromne množice pa potem dobimo enega ali več pozitivnih mutantov z željeno izboljšano lastnostjo.

Poznamo tudi DNA shuffling oz "molecular breeding", kjer je omogočena in vitro rekombinacija DNA sekvenc, ki so bolj ali manj sorodne.
DNA shuffling potrebuje stopnjo sorodnosti 55% in več. Npr Incremental truncation za kreacijo hibridnih encimov(ITCHY) pa dovoljuje manjšeo sorodnost.

DNA shuffling: vzamemo npr dva gena z neko nukleotidno sorodnostjo(večina v amino delu), ki rezultirata v sete hibridnih knjižnic. Generirani so multipli crossing overji, ki bodo v večini ravno v tem amino terminalnem delu. Dolžina rekombinantov je približno enaka starševnskim.

ITCHY: gre za 1 sam crossing over z posledično ligacijo. Rezultat je 1 crossing over na sekvenco brez regijske preference. Dolžina rekombinantov pa zelo varira (do (A+B)).

Z temi tehnikami so nor izboljšali proteinsko topnost in expresijo, enantioselektivnost, stabilnost in aktivnost v "čudnih" okoljih, naredili nove alosterične interakcije, boljše encime skozi celotno T območje... itd.

Da, sekundarne strukture ti tud jaz napovem z 70% verjetnostjo. Gre pač zato, da so določene AK rade na točno določenih mestih v npr. alfa heliksu in da neketere ne morejo bit tam. Še vedno pa ne moremo napovedovat struktur z več kot max 80% verjetnostjo.

Za 3D strukture moraš pa uporabiti template protein z že znano 3D strukturo v online knjižnici Protein Data Bank, potem pa z komparativnim modelingom na ModBase database primerjaš template z željenim proteinom.

Če te pa zanimajo podrobnosti pa odpri temo.

tole napovedovanje se grem jaz dnevno v službi oz. to je moj kruh.

zee:

Popravi me če se motim, ampak ti ne napoveduješ 3D struktur proteinov iz gole sekvence, ampak računaš dinamike, vezave npr ionov na proteine... itd
Vsaj tako si rekel nekaj časa nazaj.

Računalniške moči pa ni dovolj, da bi se šel napovedovanje zvijanja proteinov.

Kakor razumem, je tole univerzalni molekularni assembler. Mau bizaren sicer, ampak nič hudega.

Glavno, da se da narest čudne molekule, potem bomo že ... magari bomo v celicah vzgojili take molekule, da celic ne bomo potrebovali več.

Nekje tam smo, kot pri programskih jezikih. Hmmm ....

->Kakor razumem, je tole univerzalni molekularni assembler.

Ni ravno zelo učinkovit, ampak je pa dovolj, da bo par kemijsko - farmacevtskih domen odplaknil...