Kako poteka diagnostika koronavirusa

Čeprav je smrtnost novega koronavirusa (2019-nCoV) še vedno nizka, je spremljanje širjenja tega virusa ključnega pomena. Za ta namen pa potrebujemo dobro diagnostiko, ki je mogoča zaradi silovitega napredka biokemije v zadnjih dveh desetletjih. Razvoj metode za zanesljivo diagnostiko še pred dvema mesecema neznanega virusa je velik uspeh, ki sloni na delu predhodnikov. Virusa namreč ne moremo preprosto nagojiti v petrijevkah.

Novi virus sodi v družino koronavirusov, ki jih k sreči že dobro poznamo. Štirje povzročajo navadni prehlad in so z nami že od pamtiveka, SARS in MERS pa sta novejša in tudi nevarnejša. Tudi zaradi njiju so že leta 2005 razvozlali genom koronavirusov. Tako poznamo, kateri dela genoma hitro mutirajo, in kateri so stabilni. Za potrditev virusa je namreč treba loviti ravno prav spremenljive dele njegovega dednega materiala. Ti se ne smejo spreminjati, ko virus mutira, hkrati pa ne smejo biti tako splošni, da bi pozitivni rezultat dajali tudi ostali koronavirusi.

Koronavirusi ima dedni material zapisan v obliki RNK (in ne DNK), kar predstavlja prvo nevšečnost. Večina orodij za genske manipulacije deluje na DNK, zato je treba iz RNK koronavirusa pridelati DNK. Rešitev tega problema so v preteklosti prinesli prav virusi (retrovirusi), saj smo iz njih izolirali encim reverzna transkriptaza, ki ga virusi uporabljajo za prepis svoje RNK v DNK, ki se potem vgradi v celice gostitelja. V živih bitjih poteka transkripcija iz DNK v RNK, ki potek usmerja nastajanje proteinov. Toda retrovirusi znajo tudi obratno, sedaj pa tudi mi, kar v konkretnem primeru zelo koristi.

Reverzna transkriptaza torej prepiše RNK virusa v DNK, pri čemer se ne obremenjujemo z dejstvom, da prepiše tudi vse ostale kontaminante, ki so prisotne: DNK gostitelja, bakterije itd. Z današnjo računsko močjo je tudi v kopici sena moč najti iglo - genom koronavirusa. Tega so kitajske oblasti že objavile. Pri diagnostičnem testu uporabljamo metodo PCR. Z encimom iz vročeljubnih bakterij lahko podvojimo del DNK, ki ga zamejimo z začetnimi oligonukleotidi. Ker genom koronavirusa poznamo, vemo, katere začetne oligonukleotide moramo uporabiti, da bomo podvojili želeni del DNK. V praksi se uporablja PCR združen z reverzno transkriptazo, da sta koraka zlepljena. To je rutinska tehnika. Pri PCR gre za to, da najprej segrejemo raztopino DNK, da se vijačnici ločita, nato nanju prilepimo začetna nukleotida in nato pustimo encimu polimerazi da izdela kopiji. Tako lahko z več cikli eksponentno kopiramo isto DNK. Na koncu je vzorec praktično samo želena DNK, medtem ko je vse ostalo šum.

Na koncu je treba rešiti še problem lažnih pozitivnih rezultatov. V teoriji se začetni nukleotidi prilepijo le na ustrezna mesta na DNK. Če jih ni - torej če v vzorcu ni koronavirusa - podvojevanje ne bi smelo poteči. V praksi kljub temu sčasoma nakopiramo DNK, saj se začetni nukleotidi lahko prilepijo na podobne, a ne povsem skladne kose DNK. A ker se to zgodi sčasoma, ne pa takoj, lahko iz zamika ugotovimo, ali resnično kopiramo DNK virusa (takoj) ali zgolj smeti (zakasnitev). To pa vidimo tako, da uporabimo posebno barvilo, ki fluorescira, kadar je v raztopini prisotna dvovijačna DNK. Tako pogledamo, kdaj se začne svetlikati pozitivna kontrola in kdaj negativna, pa bomo takoj vedeli, ali je vzorec pozitiven ali ne. Kogar zanimajo tehnične podrobnosti, pa si lahko prebere priporočila CDC.