Nobelova nagrada za kemijo 2014

Na sredini tedna razglasitev letošnjih prejemnikov Nobelovih nagrad smo izvedeli, kdo prejme Nobelovo nagrado za kemijo. Za razvoj fluorescenčne mikroskopije so nagrajeni Američan Eric Betzig, Nemec Stefan W. Hell in Američan William E. Moerner. S svojimi odkritji so omogočili razvoj nove veje optične mikroskopije, ki omogoča vpogled v strukture, ki so manjše od valovne dolžine vidne svetlobe.

Več kot sto let je v mikroskopiji veljala dogma, ki jo je leta 1873 postavil Ernst Abbe in ki pravi, da ni mogoče opazovati predmetov, ki so manjši od polovice valovne dolžine svetlobe. Za vidno svetlobo to pomeni, da je meja okrog 200 nanometrov. Mejo bi lahko pomaknili niže z uporabo svetlobe krajše valovne dolžine, a ima ta že višjo energijo in vzorec bi prežgali. Elektronski mikroskopi težavo rešujejo z uporabo snopa elektronov namesto fotonov, ki imajo bistveno krajšo valovno dolžino, a to prinaša posebne težave s pripravo vzorcev.

V Romuniji rojeni fizik nemškega rodu Stefan Hell je na Univerzi v Heidelbergu raziskoval mikroskopijo in ključno sodeloval pri pripravi 4Pi-mikroskopa. Po doktoratu leta 1990 in dveh letih v heidelberškem laboratoriju za molekularno biologijo ga je pot vodila na Finsko, kjer je nadaljeval svoje delo. Še vedno ga je gnal zanos, da bi nekako presegel Abbejevo omejitev in z optičnim mikroskopom pogledal globlje pod magično mejo 200 nm. Na Finskem je deloval v skupini za fluorescenčno mikroskopijo in prav na tem področju mu je uspel velik preboj.

Fluorescenčna mikroskopija je bila v začetku 90. let živahno področje, a še vedno so znanstveniki opazovali le večje skupke molekul. Zamisel je zelo preprosta: če imamo na primer fluorescentna protitelesa, ki se vežejo na specifične dele celične DNK, jih lahko aktiviramo s pulzom svetlobe in nato opazujemo, kje svetijo. A še vedno ne bomo videli posameznih molekul in še vedno bo ločljivost tam okrog 0,2 mikrometra.

To je približno dovolj, da dobimo grobo skico prve dame med bakterijami Escherichie coli, ki v dolžino meri približno mikrometer, kaj dosti pa o njeni notranjosti težko povemo. Hell pa je v mestu Turku na Finskem dobil genialno idejo, kako bi lahko stimulirano emisijo izkoristil za izdelavo posnetkov z višjo ločljivostjo. Tehnika se imenuje STED (stimulated emission depletion) in je v principu preprosta. Vzorec osvetljujemo z dvema žarkoma, kjer je prvi nizke intenzitete in usmerjen, kolikor mu valovna dolžina dopušča, drugi pa višje intenzitete. Slednji ima v območju, kamor fokusiramo, ničelno intenziteto, v okolici pa hitro naraste. Prvi žarek flurofore v vzorcu vzpodbudi k flourescenci, drugi žarek pa fluorescenco popolnoma zaduši. Rezultat je, da fluorofori fluorescirajo samo v poljubno majhnem izostrenem območju, ki ga preiskujemo, v okolici pa ne. Potem se moramo samo še premakniti po celem vzorcu in na koncu zlepiti vse posnetke skupaj, pa dobimo končno sliko z bistveno višjo ločljivostjo. Na ta način še vedno snemamo več molekul skupaj, a lahko ločljivost izboljšamo pod mejo 0,2 mikrometra. Hell je prvi teoretični članek s to idejo objavil leta 1994, šest let pozneje pa jo je realiziral tudi v praksi.

Druga tehnika, ki sodi v razred fluorescenčne mikroskopije, pa omogoča snemanje z ločljivostjo ene same molekule. Za razliko od lepljenja slike iz tehnike STED, gre pri drugi metodi za zlaganje posnetkov enega nad drugega (superpozicija). K razvoju sta ključno prispevala W. E. Moerner in Eric Betzig. Slednji je zanimiv možakar, ki je v 90. letih delal v Bell Laboratories v New Jerseyju na področju mikroskopije z bližnjim poljem (near-field microscopy). Ko je ocenil, da tehnika ne dopušča nadaljnjih izboljšav in da akademija ni zanj, je leta 1995 znanstveno kariero obesil na klin se zaposlil v očetovem podjetju Ann Arbor Machine Company kot podpredsednik za raziskave in razvoj. V akademijo se je navdse uspešno vrnil nekaj let pozneje, ko je bral o Moernerjevem delu.

Ta je že leta 1989 uspel posneti absorpcijski spekter ene same molekule. Šlo je za pentacen (molekula s petimi spojenimi benzenovimi obroči) v kristalu p-terfenila pri 4 K. Osem let pozneje je Moerner raziskoval emisijske lastnosti zelenega flourescentnega proteina (GFP), ki so ga izolirali iz meduz. Ena izmed mutant tega proteina ima zanimive lastnosti, da jo je treba aktivirati z obsevanjem pri 405 nm, potem pa fluorescira po osvetljevanju pri 488 nm. Po kratki fluorescenci je protein deaktiviran do vnovičnega obsevanja s 405 nm. Pripravili so še številne druge mutante, izmed katerih je bila posebej uporabna Lippincott-Swartzeva, ki se aktivira z obsevanjem pri 413 nm, fluorescira po osvetljevanju s 488 nm in nato ireverzibilno deaktivira.

Betzig se je nato vrnil v raziskovalno srenjo. Opisana mutanta GFP je bila odlično izhodišče za nadaljevanje raziskav. Zamisel je spet zelo preprosta. Če imamo v vzorcu več molekul GFP, ga moramo obsevati z zelo šibkim pulom kratkega trajanja in nizke intezitete (pri 413 nm), ki bo aktiviral le manjši del molekul GFP. Vzorec potem obsevamo s 488 nm ter posnamemo rezultat. Molekule, ki so flurescirale, so sedaj deaktivirane, zato lahko aktivacijo pri 413 nm ter obsevanje s 488 nm ponovimo, pa vemo, da bodo svetile druge molekule GFP. Preostalo je le še pripraviti vzorce, ki bodo imeli GFP prilepljene na dele, ki nas zanimajo.

To ni težko, saj biokemiki znajo pripraviti fuzijske proteine, ki imajo lastnosti več genov, ki so predhodno kodirali več ločenih proteinov. Betzig je s sodelavci pripravil fuzijske proteine z vgrajenim fotoaktiviranim GFP in transmembranskega proteina (CD63). Zaradi slednjega se je fuzijski protein zasidral v membrane, GFP-del pa je skrbel za fluorescenco. In tako so posneli zelo natančno strukturo lizosoma v celicah sesalcev. Metoda se imenuje PALM (photoactivated localization microscopy), kasneje pa so razvili še številne izboljšave (fPALM, STORM, PAINT).

Nagrajena odkritja so prispevala tehnike, ki se danes uporabljajo rutinsko. Kot so zapisali v utemeljitvi nagrade, je mikroskopija postala nanoskopija, saj omogoča opazovanje gibanja in delovanja posameznih proteinov. To je uporabno za razumevanje procesov, ki povzročajo degenerativne bolezni, kot so Parkinsonova, Alzheimerjeva ali Huntingtonova.